达罗巴星是一种具有醚键和C-C键的七肽类抗生素，其两种化学键均由自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶DarE催化形成。单个DarE酶如何产生两种化学结构迥异的化学键，其作用机制至今仍不明确。本研究通过绘制达罗巴星类似物RiPP（达罗肽）的生物合成图谱，鉴定并表征了两种新型达罗肽——它们既缺乏达罗巴星的C-C键，又仅由醚键构成。系统发育分析和诱变实验表明，达罗肽成熟酶具有内在多功能性，不仅能催化醚键形成，还可催化C-C键连接及丝氨酸氧化反应。值得注意的是，不同化学产物的生成完全由底物基序决定。本研究不仅为发现新型达罗肽天然产物提供了路线图，还揭示了调控这些多功能醚键形成rSAM酶的关键机制。

图1.期刊封面图

上图为西西智研制作

图2.达罗巴克汀的生物合成过程。(A)达罗巴克汀A的生物合成基因簇（BGC）。(B)达罗巴克汀A的生物合成。该化合物的成熟过程包含两个关键步骤：首先由DarE蛋白催化形成醚键和C-C键的交联结构，随后由生产菌株（如P.khanii）或异源宿主（如大肠杆菌）中的未知蛋白酶去除前导肽和尾随肽。

七肽达罗巴星A是一种核糖体合成并经翻译后修饰的肽类物质（RiPP），对革兰氏阴性病原体具有强效广谱抗菌活性。该化合物由两个融合环状结构单元构成：通过醚键交联连接Trp1-C7与Trp3-Cβ，以及通过C-C键交联连接Trp3-C6与Lys5-Cβ。其双环结构通过形成应变的β-链构象，选择性抑制细菌外膜插入酶BamA，该蛋白是外膜蛋白折叠与插入过程中的关键因子。与其他RiPP类似，达罗巴星A源自核糖体前体肽DarA，需经翻译后修饰和蛋白酶解才能成熟。尽管化学性质迥异，但其醚键和C-C键均由单一自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶DarE催化形成。

图3.达罗肽家族隐藏序列空间解析。(A)达罗肽前体的最大似然系统发育树。本研究中涉及的达罗肽前体（包括先前研究中的pkDarA，1,9 pl-DarA，10和yi-DarA9，以及本研究中的PasA和RscA）分别用白色圆圈和黄色圆圈标注。各分支旁标注了构建该树的关键自展值。该树以异受体前体XncA为根节点。完整注释树图见图S3。(B)达罗肽家族核心肽段的概率分布序列标志图。该图清晰显示，达罗肽具有两种融合底物基序特征（即Ω1−X2−Ω3和Ω3−X4−X5），分别形成醚键交联和C-C交联。另外两个亚支仅含一种底物基序（即Ω1−X2−Ω3）。

rSAM酶家族堪称酶超家族中的“顶流”，能催化形态各异、化学性质复杂的反应。这类酶以对氧气（O₂）的敏感性著称，通过保守的[4Fe−4S]铁硫簇实现还原裂解，精准切断S-腺苷甲硫氨酸的S−C5′键（SAM).）。生成的5′-脱氧腺苷（dAdo）自由基随后从底物中夺取氢原子，启动多种生物转化反应。在RiPP生物合成途径中，rSAM酶通常催化侧链交联反应（即形成C−S/C−O/C−N/C−C键），将（杂）环烷烃或环芳烃单元精准嵌入多肽底物。

图4.光敏素A的发现与结构解析。(A)光敏素A的BGC结构。(B)光敏素A的合成路径示意图。(C)大肠杆菌共表达PasAB蛋白的细胞裂解液HPLC谱图，显示存在光敏素A(1)。(D)光敏素A中Trp1-4/5/6和Phe3-α/β位点的HSQC切片聚焦图。(E)解析光敏素A平面结构的关键二维核磁共振相关性图。(F)光敏素A的化学结构式

DarE酶从外源性氧气源处从头构建醚键交联的能力，在生物化学领域堪称史无前例。更令人惊叹的是，单个DarE酶如何同时形成化学性质迥异的C-C交联和醚键交联的机制，至今仍是个未解之谜。鉴于DarE酶的神奇特性，对含有类似达罗巴克汀醚键交联的RiPPs（即达罗肽9）进行深入研究，必将为相关领域带来全新认知。

图5.孤儿多肽基因簇（rsc）的代谢通路重构。(A)rsc的BGC（生物合成基因簇）及其前体肽序列。预测核心肽和引导肽中的氨基酸残基分别用正负数字标注。(B)胰蛋白酶消化结合分子网络分析显示，化合物3、4、5为RscB的三种产物。(C)利用LC-HRMS和MS/MS数据对3、4、5进行表征并定量分析产物比例。详见表S10-S12中三种化合物的MS/MS数据分配。AUC表示色谱图下的面积。(D)RscB催化作用的假说模型。展示的修饰型RscA结构突出了RscB形成的两个醚键交联结构。

图6.PasB蛋白的体外重构与机制研究

图7.rSAM酶最大似然系统发育树，包含多肽成熟酶、anSMEs、3-CyFEs及其他rSAM C−O/C−S/C−C交联酶。以NosL作为外群参考。为便于比较，各酶类的底物模式也一并标注。树构建的关键自展值标注于各分支

图8.PasB的底物调控催化机制。(A)反应机理示意图展示了PasB的底物调控催化特性。PasB可催化三种反应：醚键交联、碳-碳交联及丝氨酸氧化，分别由底物基序Ω1−X2−Ω3、Ω1−X2−X3和Ω1−X2−S3调控。(B)底物突变研究揭示了PasB的催化多功能性。PasB对各底物的相对活性表示共表达产物的估算转化率。星号表示根据核磁共振（HRMS）推断的极低产率。N.D.表示未检出。(C)通过液相色谱-核磁共振（LC-HRMS）分析，6升共表达产物PasA-F47K/PasB的总离子色谱图。灰色峰对应未修饰的PasA-F47K，蓝色峰对应含碳-碳交联的修饰型PasA-F47K。两种物质的核磁共振谱图见图S52。(D)用于推断化合物6平面结构的关键二维核磁共振相关性。(E)化合物6的化学结构及其核磁共振

在达罗巴星发现仅四年后，本文在其生物化学机制研究领域已取得重大突破。该化合物不仅展现出卓越的抗生素活性，其由rSAM酶DarE从头构建醚键的生物合成机制更是史无前例。通过系统解析达罗肽的生物合成路径，发现这种独特的生物化学机制不仅存在于达罗巴星，更可能广泛存在于天然产物的生物合成过程中。光合肽与RscB产物的特性研究，为含有醚键构建的应变环状结构的RiPPs家族增添了新成员。本研究为发现新型达罗肽天然产物及赋予多环结构的新型生物催化剂提供了路线图。达罗巴星成熟过程中的一个关键谜题是：为何且如何由单一酶同时构建化学性质迥异的醚键与C-C键？

本研究揭示，达罗肽成熟酶可能源自3-CyFEs和anSMEs的祖先序列，并继承了这两类酶的功能。此外，还发现达罗肽成熟酶的催化效果受底物序列调控，首次阐明了rSAM酶卓越多功能性的控制机制。在RiPP生物合成和rSAM酶学中，底物控制的酶催化现象已被证实。这些案例表明，底物在决定催化结果方面起着关键作用。Daropeptide成熟酶显然开创了一个全新范式——酶活性通过底物依赖的共底物（即O₂）进行调控，这揭示了底物、共底物与酶在催化这些非凡rSAM酶时存在复杂且此前未被充分认识的相互作用。该研究不仅凸显了RiPP生物合成中涉及的丰富生化机制，更展示了通过调控RiPP生物合成酶实现多肽骨架结构多样性突破的巨大潜力。

本文内容来自期刊J. Am. Chem.Soc. 2023, 145, 22945−22953， 以Substrate-Controlled Catalysis in the Ether Cross-Link-Forming Radical SAM Enzymes 为题的文章。原文链接：

https://doi.org/10.1021/jacs.3c04355

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