基于CRISPR的适配体传感器在检测非核酸靶标领域已获得广泛应用。然而，亟需开发一种易于定制的设计方案，以提升信噪比、增强通用性并拓展检测范围。本文报道了一种基于CRISPR的可编程适配体传感器（CPAS）平台。该平台包含由适配体序列、锁链DNA和crRNA识别区组成的单链DNA，通过互补杂交形成发夹结构。利用T4 DNA聚合酶，crRNA识别区通过茎环延伸转化为完整的双链DNA，从而激活Cas12a的转录切割活性并产生荧光信号。当目标分子与适配体特异性结合时，会破坏发夹结构的形成，导致荧光信号变化。值得注意的是，该CPAS平台仅需更换适配体序列和锁链DNA即可轻松实现定制化改造，无需调整crRNA序列。研究发现，SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）的DNA锁库区域最佳碱基数量为7个核苷酸，ATP区域则为4个核苷酸。CPAS平台对S蛋白和ATP检测具有高灵敏度。通过与侧向流动检测技术结合，可在1小时内实现灵敏检测，展现出其在便携式分析领域的巨大潜力。

图1.期刊封面图

上图为西西智研制作

图2.CPAS平台检测S蛋白与ATP的可行性评估。(a)当存在适配体DNA、T4 DNA聚合酶、Cas12a-crRNA及F-ssDNA-Q时。(b)当存在S蛋白/ATP、适配体DNA、T4 DNA聚合酶、Cas12a-crRNA及F-ssDNA-Q时。(c)当存在适配体DNA、Cas12a-crRNA及F-ssDNA-Q时。

近年来，具有制造简单、便携性强、特异性高等优势的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，在分子诊断领域得到广泛应用。 Cas12a和Cas13a等各类Cas蛋白通过顺式和反式切割活性，被用于生物传感器中实现特异性识别与信号放大。当CRISPR RNA（crRNA）与靶DNA结合时，Cas12a会被激活，导致双链DNA（dsDNA）发生位点特异性断裂，并对周围单链DNA（ssDNA）产生非特异性切割。类似地，Cas13a能识别单链RNA（ssRNA），既能切割靶序列，又能对周围单链RNA进行切割。

图3.适配体传感器结构优化实验。(A)不同长度锁链DNA（5、6、7、8、10和12个核苷酸）在无S蛋白（30 nM）与有S蛋白（30 nM）条件下的荧光输出对比。(B)使用CPAS平台检测S蛋白（30 nM）时，锁链DNA长度对检测效果的影响。(C)不同长度锁链DNA（2、3、4、5、6、7和8个核苷酸）在无ATP（500μM）与有ATP（500μM）条件下的荧光输出对比。(D)使用CPAS平台检测ATP（500μM）时，锁链DNA长度对检测效果的影响

然而，由于CRISPR系统无法直接识别蛋白质或小分子，它需要借助信号转导策略来建立连接。陈等人提出了一种基于CRISPR/Cas13a的创新信号放大免疫吸附检测法，用于超低浓度蛋白质的检测。该方法采用抗原-抗体相互作用作为信号转导机制。不同于酶法，这种方法在酶联免疫吸附检测（ELISA）中使用含有T7启动子的生物素化双链DNA，从而将免疫结合转化为Cas13a-crRNA的识别与激活。值得注意的是，该方法的灵敏度显著优于传统ELISA，灵敏度高出100倍。

图4.CPAS蛋白检测平台实验数据。(A)不同浓度S蛋白对CPAS平台的荧光响应光谱。(B)F0/F比值与S蛋白浓度对数呈线性关系。(C)F0/F比值与S蛋白浓度呈线性关系。(D)使用商用ELISA试剂盒检测S蛋白的线性关系。(E)CPAS平台对20 nM非特异性靶标的荧光响应。(F)CPAS平台对伪SARS-CoV-2病毒和VSV-G伪病毒的荧光响应

除了抗原-抗体反应外，某些替代性生物识别元件（如适配体和DNA酶）可与CRISPR/Cas系统结合，用于检测非核酸类靶标。适配体是稳定的DNA或RNA分子，能形成特定结构，对目标分子具有高亲和力和特异性，从而将靶标识别转化为输出信号。适配体具有稳定性高、合成成本低、靶标范围广等优势。值得注意的是，适配体在生物传感中的应用有效克服了CRISPR免疫检测的局限性，包括复杂的信号转导和异质性系统。适配体传感器通常采用部分或完全互补的锁库DNA序列来阻断非特异性识别，当靶标与适配体复合物特异性识别时，锁库DNA被释放，从而产生可检测信号。长链锁库DNA序列锁链DNA难以释放，导致特异性信号强度降低；而过短的锁链DNA序列则无法有效阻断非特异性结合并启动后续步骤。因此，要获得最佳信噪比，必须精心选择锁链DNA的长度。目前已有多种策略应对这一挑战，其中最小锁链DNA长度为11个核苷酸的方案被广泛采用。但即便如此，这种长度仍会限制适配体传感器对弱亲和力靶标的检测性能。

图5.CPAS平台检测ATP的荧光特性分析。(A)CPAS平台对不同浓度ATP的荧光光谱响应。(B)F0/F比值与ATP浓度的线性关系曲线。(C)CPAS平台对200μM非特异性靶标的荧光响应。(D)ATP在缓冲液及稀释人血清中不同浓度（2、20、200、500和1000μM）的荧光响应

 本研究开发了一种可编程检测蛋白质和小分子的系统，命名为CRISPR介导的可编程适配体传感器（CPAS）平台。该平台将适配体识别元件与CRISPR/Cas12a信号转换及扩增组件相结合。SARS-CoV-2刺突蛋白(S)和三磷酸腺苷（ATP）被选作目标分析物，通过将目标结合事件与Cas12a的跨酶切活性相关联，从而调控荧光信号。CPAS平台的灵活性使其只需调整适配体序列和锁扣DNA即可检测不同目标，无需修改crRNA识别区域。该平台采用统一的Cas12a-crRNA系统，兼具操作简便与功能多样。还深入研究了锁扣DNA长度的影响，发现检测S蛋白和ATP的最佳长度分别为7个和4个核苷酸。这项研究为提升适配体传感器的信噪比、拓展可检测靶标范围开辟了无限可能。

图6.CPAS平台与LFA的集成应用。(A)S蛋白在不同浓度（0、0.002、0.02、0.2、2×10⁻¹⁰、20和30 nM）下的分析。(B)S蛋白检测中T线与C线的强度比。(C)ATP在不同浓度（0、0.2、2、20、200、500和1000μM）下的分析。(D)ATP检测中T线与C线的强度比

本文开发了一种用于检测蛋白质和小分子的CPAS平台。该平台通过靶标蛋白的结合诱导茎环DNA发生构象变化，从而调控Cas12a酶的活性并产生输出信号。在最佳条件下，建立了一套通用性强、快速灵敏的检测流程，可同时检测S蛋白和ATP。该方法避免了蛋白质和小分子检测中常见的异源反应和复杂信号转导问题。此外，通过调整适配体序列和锁扣DNA的长度，可检测不同分析物，有效提升信噪比并拓展诊断能力。本研究为提升适配体传感器的通用性和操作便捷性提供了新思路。

本文内容来自期刊ACS Sens. 2024, 9, 244−250.以Programmable Aptasensor for Regulating CRISPR/Cas12a Activity 为题的文章。原文链接：

https://doi.org/10.1021/acssensors.3c01881

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