活细胞环境中合成超分子系统的复杂动力学特性阻碍了瞬态层级结构与生物功能之间的关联性建立。要实现这种关联，需要突破性地将合成化学对离散时间点超分子事件的精确控制与原位细胞实时可视化技术相结合。本研究报道了两条肽序列在可见光诱导下发生分子与超分子转变，从而在细胞内形成多种组装体。相较于内源性刺激响应型组装，这种光化学策略能完全控制光解反应——单体生成速率与局部浓度直接调控后续组装动力学。相位荧光寿命成像技术追踪了细胞内伴随单体激活与消耗形成的不同组装态，而关联光学-电子显微镜技术则揭示了细胞内纳米纤维的形成。这种时间分辨的组装过程表明，细胞毒性的出现与寡聚体积累超过细胞外排阈值密切相关。

图1.期刊封面图

上图为西西智研制作

图2. 可见光触发肽纳米结构细胞内组装的示意图

       图解大意为：a，光笼前体组装肽1和2的化学设计，其细胞内纳米纤维的形成可通过光照控制。b，前体组装肽1和2（τf=1.20 ns）通过"Arg5"介导的内吞作用进入A549细胞。可见光作为外部刺激源，能在照射下将1和2转化为自组装肽1a和2a。照射时间可调控组装单体1a和2a的生成浓度，进而控制活细胞内组装状态与动态过程。组装动态通过τf值在1.20 ns与0.17 ns间的光子变化进行监测。

图3.光解反应的分子设计与动力学分析

图解大意为：通过LC-MS对光解反应进行了优化。在pH 7.4（20 mM）的NH4HCO3缓冲溶液中，前体化合物1在避光条件下可稳定存在24小时。当使用505 nm波长、9.2 mW cm−²的光照时，1（25 µM）的酯键在水性缓冲液（NH4HCO3缓冲液，pH 7.4，20 mM）中发生水解，形成自组装肽1a并释放出光笼精氨酸衍生物3。光照5分钟后，可观察到1的显著消耗，同时出现两个保留时间（tR）分别为6.91分钟和3.52分钟的新峰，其质荷比（m/z）分别与1a（[1a+H]+的m/z=540.4，[1a+Na]+的m/z=562.3）和3（[3+H]2+的m/z=636.2，[3+H]+的m/z=1,270.9）的化学式相符。延长光照时间至20分钟时，1向1a的转化率达到98%；30分钟光照后1完全消失。当光照时间延长至40和50分钟时，未观察到对光解过程的进一步影响。为验证前体2同样可被505 nm光裂解，研究人员测定了相应的光解反应动力学。结果表明，2（2.5 µM）的酯键在505 nm光照10分钟内完全水解，形成肽2a。

图4.   观察到光诱导自组装过程中随时间形成的纳米纤维

上图通过动态光散射（DLS）分析对光诱导自组装现象进行了初步研究，数据显示多肽在光照时间延长过程中会发生聚集（图3d）。在未受光照条件下，25微摩尔浓度的化合物1在pH 7.4（50毫摩尔）的磷酸盐缓冲液（PB）中保持溶解状态，未出现聚集现象。光照1分钟后即开始形成纳米级聚集体，随着持续光照10分钟，这些聚集体逐渐增大最终形成微米级的光致聚集体（"光聚体"）。研究人员采用相同光照时长的透射电子显微镜（TEM）对光聚体的纳米结构和形貌进行了时序成像观察，发现随着光照时间延长，具有明显特征的纳米纤维结构会成比例地增加纤维密度。光照5分钟后最初仅能观察到少量纤维片段，而光照15分钟后则出现显著的纤维数量增长。

图5.延时相位荧光寿命成像显微镜分析显示，在不同辐照时间（505纳米波长，9.2毫瓦/平方厘米）条件下，1号与2号样本的内化过程及组装状态变化

上图主要表达了随时间推移的聚集进程可通过相量图上两个特征相量（分别代表单体和聚集体）之间光子群分布的移动来追踪。在无光照条件下，前体物质表现出均一的单组分荧光衰减，τf=1.20纳秒。经光照后，光笼肽（1和2）生成相应的活性单体（1a和2a），这些单体随后自组装成τf值降低的纳米纤维。照射5分钟后，相量分析显示细胞内光子呈现1.20纳秒>τf>0.75纳秒的荧光寿命，表明主要组分仍为单体，同时首次观察到组装体的痕迹。当辐照时间延长至10分钟时，可观察到细胞形态变化，同时出现寿命τf=0.17纳秒的新光子群，表明纳米纤维开始形成。继续辐照15分钟后，生成的单体被进一步消耗，伴随寡聚体和组装体的形成。辐照30分钟时，细胞内前体物质被完全耗尽，对应τf=0.17纳秒的光子群显著增加，意味着大多数超分子物种已转化为组装体。最终，40分钟辐照使光笼肽完全转化为组装体。

图6.A549细胞在505纳米波长、9.2毫瓦/平方厘米强度照射15分钟后，内部纳米纤维形成的CLEM分析

上图表达了在50%辐照强度（4.6毫瓦/平方厘米）条件下，相量荧光寿命成像分析显示组装动力学较慢，组装起始需要至少30分钟的辐照时间。单体完全消耗仅在40分钟辐照后才被观察到。这一发现证明了该光响应系统在调控细胞内组装过程方面的多功能性。通过将IR780荧光与相关电子显微镜（CLEM）技术相关联，在15分钟辐照（505纳米，9.2毫瓦/平方厘米）后检测到纳米纤维的存在）。这些纳米纤维分布于细胞质和类似内吞体的囊泡结构中，这与细胞穿透肽31诱导的内吞作用过程相符。

图7.相位因子荧光寿命成像分析及细胞活性研究：针对不同辐照时间（505纳米，9.2毫瓦/平方厘米）处理后1至4小时培养期内各组装状态与动力学的比较

上图表达了在组装过程中，活性单体根据其局部浓度被消耗，这一过程决定了纳米结构的形成机制。当局部浓度低于临界聚集浓度（CAC）时，组装不会启动，也不会形成任何纳米结构。反之，当活性单体浓度超过CAC时，其生成速率与消耗速率将共同决定纳米结构的形成程度。若活性单体的光解生成速率超过其组装消耗速率，即使关闭光源后，过量活性单体仍会持续进行组装，从而导致超分子聚合过程的时间精确性丧失。为验证这些限制条件，我们对A549细胞的组装过程及后续生物效应进行了系统分析。在相同4小时峰值内化作用后，细胞分别接受5、10、15和30分钟的光照处理——该时长对应于无细胞条件下光笼前体（化合物1和2）的光解转化时间，以此控制进入后续组装过程的活性单体数量。随后进行1-4小时的暗培养，期间通过相位分析和细胞活力检测来观察组装进程及相关生物效应。

本文通过光笼化前组装肽实现了对复杂细胞环境中可见光诱导超分子组装的可控成像。结合成像技术，实现了对多种组装态生成的精确控制及这些过程的实时成像。通过整合成像与相关生物学检测，研究发现：在肽组装初期，寡聚体的形成不会引发可观测的细胞毒性效应，只有当超分子组装体形成足够数量时才会出现显著细胞毒性。进一步通过对辐照后A549细胞进行相位分析，在细胞层面更详尽地阐释了组装的复杂动力学过程。观测结果表明，单体浓度、生成速率与消耗速率会显著影响细胞内的组装动力学。尽管光解反应的分子相位可实现精确控制，但当单体生成速率超过消耗速率时，超分子相位的调控将变得极具挑战性。时序细胞活力分析显示，细胞毒效应与胞内形成的纳米结构数量密切相关。本研究实现了离散时间点超分子事件的精准调控，相关成像技术为天然细胞内的动态组装过程提供了新认知。这些成果将为解决超分子药物研发及相关生物医学研究的难题开辟新路径。

本文内容来自期刊Nature Synthesis 第4卷 | 2025年6月 | 第673–68页，以Intracellular assembly of supramolecular peptide nanostructures controlled by visible light为题的文章。原文链接：https://doi.org/10.1038/s44160-025-00751-5

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