信使RNA（mRNA）疗法在众多医疗领域展现出巨大潜力。脂质纳米颗粒（LNPs）作为目前临床应用最成熟的mRNA递送载体，但脱靶效应和肝脏蓄积等挑战限制了其更广泛的临床应用。尽管高通量筛选技术能有效筛选出更高效的选择性可离子化脂质，但其需要大量实验验证的特性制约了实际应用。本研究开发深度学习模型，通过虚拟预测高效可离子化阳离子脂质来加速优化过程。将该模型应用于双羟乙胺衍生物脂质（BDLs）系列后，成功筛选出24种具有递送效率和器官选择性验证潜力的候选物。其中，YK-407展现出卓越的体外转染效率和体内器官特异性mRNA递送能力。YK-407纳米颗粒（LNPs）主要靶向脾脏，尤其是抗原呈递细胞（APCs）。在小鼠卵清蛋白（OVA）肿瘤模型中，包裹OVA-mRNA的YK-407纳米颗粒几乎完全抑制了肿瘤生长，并在脾脏中诱导出强烈的细胞毒性CD8+T细胞反应，其效果优于已获批的SM-102和Dlin-MC3-DMA。此外，发现YK-407纳米颗粒对肝脏和脾脏的毒性极低，未引发显著的炎症细胞因子释放。这些发现凸显了人工智能在癌症治疗（LNP）开发中的潜力，而YK-407在基于mRNA的治疗应用中展现出巨大前景。

图1.期刊封面图

由西西智研制作

图2.深度学习模型架构。(a)模型工作流程的概览。(b)编码器模块的结构。(c)特征处理模块。

模型包含三个核心模块：编码器、特征处理模块和解码器。输入数据由AIS标记构成，这些标记采用随机嵌入方法进行嵌入处理，并在随机嵌入中融入位置编码。编码器由多个编码层组成，每个编码层包含多头自注意力层、残差连接归一化层、前馈全连接层以及另一层残差连接归一化层。本研究中编码器包含四个编码层，多头自注意力机制设有四个头，隐藏层特征维度为64。特征处理模块用于计算两个分子的潜在向量差异。具体来说，该过程包含两个关键步骤：首先将潜在向量与不同结构掩码（DSM）进行点积运算，生成反映分子结构差异的潜在向量；随后通过相减运算计算两个潜在向量的差异值。解码器由三个线性层构成，首层和次层均采用GLUE激活函数，并在第一、第二线性层后添加了Dropout层。首层线性层的输入维度与潜在向量维度（1024）保持一致，第二层线性层的输入和输出维度均为1024。最终线性层的输入维度仍为1024，输出维度则调整为1。

图3.可离子化脂质的优化与合成。(a)本研究中使用的双羟乙胺衍生脂质（BDLs）的化学结构及其用于制备脂质纳米颗粒（LNPs）的配方。(b)本研究中合成的6种不同头部基团和10种不同脂质尾部的结构。

先前针对脾脏靶向脂质纳米颗粒（LNPs）的研究表明，引入多种叔胺基团具有显著优势。研究还发现，乙醇胺能有效抑制水合层形成，同时增强核酸相互作用，从而提升药物递送效率。基于这些发现，开发了一种可离子化脂质体系：其头部具有对称结构，包含两个通过2-4个碳原子连接的乙醇胺类似基团，同时配备两个脂质尾部，这些尾部结构既可保持一致也可存在差异。研究人员将可离子化的脂质候选物命名为双羟乙胺衍生脂质（BDLs），并利用深度学习模型预测其具有高转染效率和肝脏低蛋白翻译的特点。根据预测结果，筛选出24种具有高递送效率的BDLs，并成功合成用于后续实验验证。这24种BDLs包含六种不同头部基团和十种不同脂质尾部结构。

图4.BDL-LNPs的理化特性分析与体外筛选。(a)LNP制剂的制备流程示意图，采用微流控装置完成。(b)不同BDL制备的脂质纳米颗粒（LNPs）理化特性对比。所用LNPs组分：BDL：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000=40：10：48.5：1.5，内含Fluc-mRNA。(c)不同BDL-LNPs递送Fluc-mRNA后HEK293T细胞的相对生物发光强度。(d)用于后续体内研究的候选化合物YK-407的化学结构，以及对照组脂质SM-10248和Dlin-MC3-DMA的结构示意图。

对于不对称的BDLs，脂质尾部是按顺序引入的，首先使用Boc保护的头基（图S3c）。适用于mRNA递送。动态光散射（DLS）分析显示，所有PDI值均低于0.10，表明颗粒具有优异的单分散性和均匀性。采用体外Fluc检测法定量评估了不同BDL-LNPs在HEK293T细胞中的转染效率。结果表明，即使结构上的微小变化也会显著影响转染效率。具体而言，YK-407表现出最高的发光信号，而两个叔胺之间插入额外的甲烯基团（YK-413）则显著降低了转染效率。值得注意的是，YK-407与YK-405在脂质尾部的甲烯基差异仅导致转染效率变化三倍，突显了尾部结构优化的重要性。令人满意的是，YK-407的转染效率比先前报道用于递送新冠奥密克戎疫苗的YK-009高出1.5倍。基于这些体外筛选结果，YK-407被选中用于进一步的体内实验。

图5.YK-407和SM-102在体内脾脏中表现出选择性，并能有效靶向抗原呈递细胞（APCs）。(a)和(b)为注射后6小时不同剂量Fluc-mRNA LNPs（0.25 mg/kg）肌肉注射雌性BALB/c小鼠的全身生物发光（IVIS）图像(a)及主要器官生物发光(b)。(c)和(d)为注射0.5 mg/kg eGFP-mRNA LNPs肌肉注射24小时后，不同类型脾细胞中表达的eGFP阳性细胞流式定量分析(c)及代表性流式细胞图(d）

脾脏靶向递送能力可能与循环过程中脂质纳米颗粒（LNPs）表面的蛋白冠有关25，但具体机制尚需深入研究。这些发现表明，YK-407是脾脏特异性递送的潜力候选药物，有望显著降低肝脏毒性。

图6.YK-407 OVA-mRNA疫苗对MC38-OVA肿瘤模型的治疗效果。(a)治疗研究设计示意图。将MC38-OVA细胞植入小鼠体内，并在第3、6、9、12、15和18天分别接种OVA-mRNA/LNPs疫苗，疫苗配方包含YK-407、SM-102或Dlin-MC3-DMA（MC3），剂量为0.15毫克/千克。(b)-(d)治疗后肿瘤体积变化(b)、生存曲线(c)及体重变化(d)（n=8）。统计分析采用双因素方差分析结合邓尼特多重比较检验。

接下来，评估了YK-407在肿瘤治疗中递送mRNA疫苗的治疗潜力，使用MC38-OVA结直肠癌小鼠模型和B16F10黑色素瘤模型进行实验。本研究中，C57BL/6小鼠在第0天皮下接种1.5×10⁶个MC38-OVA或B16F10细胞。随后，在MC38模型肿瘤平均体积达到54立方毫米时（图6a），分别于第3、6、9、12、15和18天，通过肌肉注射方式给予由YK-407、SM-102或Dlin-MC3-DMA配制的OVA-mRNA脂质纳米颗粒。对于B16F10模型，分别在第3、6和10天通过肌肉注射或静脉注射方式，给予封装Trp2（酪氨酸酶相关蛋白2）-mRNA的YK-407和SM-102。Trp2作为肿瘤相关抗原，在B16F10黑色素瘤模型中具有重要作用。在MC38模型中，三种LNP制剂均显著抑制了肿瘤生长。实验成功实现了OVA-mRNA的递送并诱导免疫应答。更重要的是，YK-407制剂几乎完全抑制了肿瘤生长，这可能得益于其选择性脾脏靶向作用和向抗原呈递细胞（APCs）的高效递送。此外，接种YK-407的小鼠在实验期间存活率高达100%。值得注意的是，与PBS组相比，SM-102和Dlin-MC3-DMA组未出现显著体重下降。YK-407组在第15天的体重较对照组显著降低，这很可能归因于肿瘤重量的大幅减少。

图7.OVA-mRNA脂质纳米颗粒（LNPs）在脾脏中诱导出显著的OVA特异性细胞毒性CD8+T细胞应答。(a)治疗研究设计示意图。小鼠被植入MC38-OVA细胞，并在第3、6、9、12、15和18天接种OVA-mRNA/LNPs疫苗，疫苗配方包含YK-407、SM-102或Dlin-MC3-DMA（MC3），剂量为0.15毫克/千克。第24天收集脾脏用于后续实验。(b)和(c)ELISpot检测图像(b)及接种组小鼠脾脏内分泌IFN-g的T细胞点数(c)（n=8）。(d)和(e)FACS定量分析(d)及接种组小鼠脾细胞中携带T细胞受体结合H-2Kb OVA四聚体-siinfekl的CD8+T细胞代表性流式细胞图(e)（n=5）。统计分析采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验

为深入探究观察到的抗肿瘤作用机制，研究人员于第24天采集脾脏组织进行后续分析。实验结果显示，未接种疫苗的组别在siinfekl刺激下未检测到免疫应答，而所有接种组均显著增加了IFN-γ分泌型T细胞，表明mRNA疫苗能有效诱导强效T细胞应答。随后检测了细胞毒性CD8+T细胞的生成情况。与未处理对照组相比，siinfekl特异性CD8+T细胞在YK-407、SM-102和Dlin-MC3-DMA组中的比例分别增加了21.5-fold倍、11.7倍和11.7倍。这些结果表明，YK-407制剂能有效促进抗原特异性T细胞在脾脏中的增殖，其诱导的T细胞应答强度显著强于SM-102和Dlin-MC3-DMA组。

图8.YK-407 LNP构建体的体内安全性评估。(a)BALB/c小鼠接种含YK-407的OVA-mRNA-LNPs疫苗后，分别在第0、3、7天接种三次，第12天检测血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、肌酐（CRE）和尿素（URE）水平（n=3）。对照组为未接种疫苗的小鼠。(b)BALB/c小鼠接种含YK-407的OVA-mRNA-LNPs和灭活疫苗（DPBS）后，第12天对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行组织病理学检查（H&E染色）（n=3）。(c)首次接种后6小时血清细胞因子水平检测（n=3）。统计分析采用非配对单尾学生t检验。

为评估YK-407纳米脂质体（YK-407 LNPs）的临床应用安全性，研究人员通过皮下注射方式向BALB/c小鼠体内给予0.5毫克/千克的OVA-mRNA纳米颗粒。通过检测多项血液生化指标，评估其对肝脏和肾脏的潜在毒性。结果显示，YK-407治疗仅引起血清天冬氨酸转氨酶（AST）水平轻微下降。丙氨酸转氨酶（ALT）、尿酸（UREA）和肌酐（Crea）均未出现显著变化，表明肝脏和肾脏毒性极低。此外，研究人员还采集了小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏等主要器官进行组织病理学检查。结果显示，所有器官均未发现明显病理改变。

      开发了一个深度学习模型，用于筛选更高效的可离子化脂质以实现mRNA递送。通过将该模型应用于一系列双羟乙胺衍生脂质（BDLs），预测出24种脂质具有高转染效率，研究人员对其mRNA递送性能和器官特异性靶向能力进行了评估。经过脂质配方优化后，所得脂质纳米颗粒（LNPs）展现出理想的粒径和多分散指数。其中，YK-407在体外转染效率和体内脾脏特异性靶向方面表现突出，能将mRNA精准递送至脾脏内的主要抗原呈递细胞（APCs）。在小鼠卵清蛋白（OVA）肿瘤模型中，YK-407 LNP递送的OVA-mRNA几乎完全抑制了肿瘤生长，其效果优于SM-102和Dlin-MC3-DMA，充分彰显了该疫苗的临床应用潜力。进一步的机制研究表明，YK-407 mRNA疫苗在脾脏中诱导了更强的OVA特异性CD8+T细胞免疫反应，这可能是其显著抗肿瘤效果的关键因素。研究还证实，YK-407 mRNA疫苗具有良好的体内安全性特征，为未来临床应用奠定了基础。

本文内容来自期刊J. Mater. Chem. B, 2025年发表, 第13卷, 11611–11620页, 以Prediction of high-performing spleen-targeted lipid nanoparticles using a deep learning model for robust anticancer immunotherapy为题的文章。原文链接：

DOI: 10.1039/d5tb01217a

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