直接注射干细胞是软骨修复的理想微创策略。然而，由于存在不良免疫微环境、细胞存活率低、关节滞留时间短以及分化方向无序等问题，其治疗效果和临床应用面临显著限制。为此，本文采用新型数字光加工（DLP）3D打印技术，成功制备出一种生物活性“一体化”微球（MSs），该微球整合了滑液源间充质干细胞（SF-MSCs）与载有卡托素（KGN）的聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）纳米颗粒，可实现微环境重塑、延长药物释放周期并促进干细胞定向分化。基于直接光固化（DLP）技术的3D打印技术能在数秒内打印数千个微球，并在无剪切力作用下保持细胞高活性。这些打印出的微球具有预设的“诊断”逻辑，可解读病理线索；同时具备“治疗”逻辑，通过延长药物释放时间来募集内源性干细胞并促进间充质干细胞（MSCs）的软骨分化。特别值得注意的是，打印微球可通过富含半胱氨酸的蛋白61（CCN1/CYR61）介导下游整合素/PI3K/Akt信号通路的激活，有效促进SF-MSCs的软骨分化。体内研究表明，具有组织粘附能力的打印微球能促进干细胞长期滞留关节并加速软骨再生。这项研究成功实现了“一体化”微球系统的快速量产，为持续药物递送和干细胞移植提供了便捷解决方案。

图1.Scheme图  软骨修复用生物活性“一体化”微球的制备示意图。受天然关节软骨复杂成分启发，我们合成了仿生生物墨水GelMA/HANB/TA，并提取间充质干细胞（SF-MSCs）与载有KGN的PLGA纳米颗粒结合，通过快速3D打印技术制成生物活性“一体化”微球。这种具有组织粘附性、优异抗氧化和抗炎效果的微球可直接注入软骨缺损部位，释放KGN促进SF-MSCs迁移分化，实现“一步到位”的软骨修复

上图为西西智研制作

图2.GelMA/HANB和GelMA/HANB/TA水凝胶生物墨水的抗氧化能力及抗炎能力分析。A)GelMA/HANB/TA的ROS清除和巨噬细胞极化机制示意图。B)经空白处理（PBS）、PBS +过氧化氢、GelMA/HANB +过氧化氢及GelMA/HANB /TA +过氧化氢处理后的SF-MSCs钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）染色结果。C)不同组别（空白处理（PBS）、PBS +过氧化氢、GelMA/HANB +过氧化氢及GelMA/HANB /TA +过氧化氢）中SF-MSCs的细胞活力。D-E)通过ROS探针（DCFH- DA）验证不同处理后的ROS清除能力(D)及相应荧光强度变化(E)。DCFH-DA发出的绿色荧光表明存在ROS。F-G)用含0.1 mM过氧化氢的培养基培养的SF-MSCs经GelMA/HANB和GelMA/HANB/TA水凝胶生物墨水染色后的共聚焦图像(F)及相应荧光强度统计(G)。以正常完全培养基培养的SFMSCs作为阴性对照（NC）组。H-I)流式细胞术分析(H)及定量数据表明M2型（CD206 +）/M1型（CD86 +）巨噬细胞比例(I)。J)将骨髓源性巨噬细胞接种于不同水凝胶生物墨水后，经LPS刺激24小时，通过荧光染色检测细胞骨架及M2生物标志物CD206（绿色）与M1生物标志物CD86（红色）的表达情况。K-L)CD206(K)和CD86 (L)相对荧光强度的定量分析。M−P)通过不同处理条件（TNF-α(M)、IL-6 (N)、IL-1β (O)、IL-10(P)）检测骨髓间充质干细胞（SF-MSCs）炎症介质的表达水平

图3.生物活性“一体化”微球的制备工艺与表征。A-C)分层印刷法制备微球的示意图。D)微球形成过程示意图。生物墨水GelMA/HANB/TA经紫外线照射后能快速形成水凝胶（紫外线可诱导HANB链上的醛基与GelMA链上的胺基发生反应）。微球可通过基于直接光固化（DLP）技术的3D打印工艺制备。E)培养皿及构建平台上打印的微球图像。F)不同直径打印微球的典型明场图像。G)打印微球直径分析结果。H)KGN包覆PLGA纳米颗粒的扫描电镜(i)与透射电镜（ii）图像。（ii）100纳米。I)通过动态光散射（DLS）测得的KGN包覆PLGA纳米颗粒流体动力学尺寸。J)打印的“一体化”微球载体。白色箭头指示PLGA纳米颗粒。K)KGN@NPs及KGN@NPs@MSs体系中KGN的包封效率

图4.生物活性“一体化”微球体的体外生物学功能评估。A)微球体培养体系示意图，用于检测细胞活力、增殖及分化能力。B)不同组别（MSs@SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN）在第7天、第14天及第21天培养的SF-MSCs负载微球体代表性明场图像。C-D)不同组别（MSs@SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN）随时间推移的活/死细胞染色(C)和细胞骨架染色(D)代表性图像。 (C)、100 μm (D)。E)不同组别（MSs@SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN）随时间推移的SF-MSCs负载微球体细胞活力变化。F)不同组别（MSs@SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN）中载有SF-MSCs的微球随时间推移的细胞数量变化。G-H)不同组别（MSs@SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN）中载有SF-MSCs的微球随时间推移的II型胶原蛋白(G)和SOX 9 (H)免疫荧光染色结果。I-J)II型胶原蛋白(I)与SOX9 (J)荧光强度随时间变化的定量分析

图5.打印的微丝组织（MS）可促进干细胞源性成纤维细胞（SF-MSCs）的体外粘附与增殖。A)MS@SF-MSCs组和MS@SF-MSCs@KGN组中，SF-MSCs与打印微丝组织共培养的代表性明场图像，分别拍摄于培养第1天、第4天及第7天。B)MS@SF-MSCs组和MS@SF-MSCs@KGN组中，SF-MSCs与打印微丝组织共培养的细胞骨架染色结果，拍摄时间点为第1天、第4天及第7天。C)不同组别（MS@SF-MSCs与MS@SF-MSCs@KGN）中SF-MSCs与打印微丝组织共培养的细胞数量随时间变化趋势。D)转孔板中SF-MSCs与打印微丝组织共培养的示意图。E)不同组别（未处理组、MS@SF-MSCs组及MS@SF-MSCs@KGN组）中SF-MSCs与打印微丝组织共培养的Live/Dead染色代表性图像，拍摄时间点随时间变化。F)不同组别（未处理组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组）中与打印骨髓间充质干细胞共培养的SF-MSCs细胞活力随时间变化。G)MSs@SF-MSCs@KGN促进伤口愈合作用的研究示意图。H-I)不同组别（未处理组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组）中与打印骨髓间充质干细胞共培养的SF-MSCs迁移过程代表性图像及定量分析。J)MSs@SF-MSCs@KGN促进细胞迁移效果的示意图。K-L)不同组别（未处理组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组）中与打印骨髓间充质干细胞共培养的SF-MSCs迁移过程代表性结晶紫染色图像及定量分析

图6.打印的MS促进了SF-MSCs的体外软骨形成分化 A)代表性宏观图像显示不同组别中与打印MS共培养两周的SF-MSCs经沙黄O染色后的结果。（Ai）200 μm（Aii）。B)代表性宏观图像显示不同组别中与打印MS共培养两周的SF-MSCs经阿尔辛蓝染色后的结果。（Bi）200 μm（Bii）。C-D)不同组别中与打印MS共培养两周的SF-MSCs代表性免疫荧光图像。胶原蛋白II、F-肌动蛋白和SOX 9均采用抗体染色。E-F)不同组别（对照组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组）中胶原蛋白II (E)和SOX9 (F)荧光强度的定量分析。G-I) RT-qPCR检测结果显示，与打印的MS共培养两周后，不同组别中成纤维干细胞（SF-MSCs）的软骨生成基因表达水平，包括II型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX 9。以软骨培养基培养的对照组作为阴性对照

图7.RNA测序技术揭示了SF-MSCs在“一体化”微流控系统中相较于二维培养皿的转录组变化。A)二维培养皿、MSs及MSs@KGN培养3天后SF-MSCs的转录组分析示意图（n = 3个独立实验组）。B）双组间差异表达基因（DEGs）的维恩图对比。C)二维培养、MSs及MSs@KGN组SF-MSCs转录组的主成分分析（PCA）。D)MSs与二维培养、MSs@KGN与二维培养、MSs@KGN与MSs的基因表达水平火山图对比。E)MSs与二维培养、MSs@KGN与二维培养、MSs@KGN与MSs的差异表达基因数量对比。F)二维培养、MSs和MSs@KGN组SF-MSCs差异表达基因的层次聚类分析（P值< 0.05且倍数变化> 2)。二维培养、MSs和MSs@KGN组成骨分化(G)与软骨分化(H)相关差异表达基因热图。I)MSs@KGN组相较于MSs组富集的GO术语。J)MSs@KGN组相较于2D组的上调GO术语富集分析。K)MSs组相较于2D组的上调GO术语富集分析。L-N)MSs@KGN组与MSs组(L)、MSs@KGN组与2D组(M)以及MSs组与2D组(N)的差异表达基因KEGG通路富集分析。O)SF-MSCs在2D、MSs及MSs@KGN组间关键分子及多种整合素差异调控的热图分析。P)C YR61、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、SOX9及II型胶原蛋白蛋白水平的Western blot检测结果，以肌动蛋白作为蛋白加载对照。Q)不同组别中与打印MS共培养的SF-MSCs中C YR61、PI3K、AKT、SOX9及II型胶原蛋白等蛋白表达水平

图8.生物活性“全能型”间充质干细胞（MSs）可延长大鼠关节腔内驻留时间。A-B)示意图展示SF-MSCS与MSs@SF-MSCs@KGN在大鼠关节腔内的时序性滞留特征。C)SF-MSCs与MSs@SF-MSCs@KGN相对荧光强度的定量分析结果。D-E)SF-MSCs及MSs@SF-MSCs@KGN在大鼠肝脏、脾脏、心脏和肾脏等关键器官中的生物分布情况

图9.生物活性“全能型”间充质干细胞促进软骨修复的体内实验及微CT评估。A)动物实验流程示意图。B)术后6周和12周时三组（未处理组、MSs@SF-MSCs组、MSs@SF-MSCs@KGN组）缺损部位的宏观影像对比。C)术后6周和12周时未处理组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组的国际软骨修复学会（ICRS）。D)术后6周时三组（未处理组、MSs@SF-MSCs组、MSs@SF-MSCs@KGN组）关节面三维重建图像、二维x轴重建图像、二维y轴重建图像、二维z轴重建图像及新骨形成情况(n = 3个关节）。E)三组（未治疗组、MSs@SF-MSCs组及MSs@SF-MSCs@KGN组）术后12周的三维重建与二维重建显微CT图像，分别展示X轴、Y轴、Z轴方向及关节新生骨形态。（三维图示：X轴、Y轴、Z轴；F-H)基于显微CT图像的骨软骨修复模型中，骨组织相对含量(F)、骨小梁数量(G)及骨小梁间距(H)的半定量分析结果

图10.修复软骨的组织学与生物力学特性分析。A)不同组别（未处理组、MSs@SFMSCs组和MSs@SF-MSCs@KGN组）修复软骨在术后6周和12周的沙黄O染色结果（黑色箭头指示正常软骨与修复软骨的交界处）。B)MODS（改良O‘Driscoll组织学评分系统）评分显示未处理组、MSs@KGN组及MSs@KGN@SF-MSCs组在术后6周和12周的评分情况。C)不同组别（未处理组、MSs@SF-MSCs组和MSs@SF-MSCs@KGN组）在术后6周和12周的II型胶原免疫组化染色结果。D-E)术后6周和12周不同组别（未处理组、MSs@SF-MSCs组和MSs@SF-MSCs@KGN组）II型胶原阳性细胞数量及表达量的定量分析结果

本文开发了一种新型生物活性“一体化”多尺度培养系统，通过基于直接激光烧结（DLP）的3D打印技术实现干细胞递送与药物持续释放。干细胞微环境是干细胞特有的生存空间，构建类似干细胞微环境的三维结构可提升移植干细胞的存活率并增强治疗效果。新型ECM类仿生生物墨水GelMA/HANB/TA能为SF-MSCs（海洋贻贝干细胞）提供适宜的生长、粘附、增殖及细胞外基质生成微环境。特别值得关注的是，源自海洋贻贝的TA作为功能性配体，不仅能促进组织粘附，还展现出显著抗氧化活性和优异抗炎特性。该系统通过编程实现“诊断”逻辑，可评估复杂微环境中多种刺激因素；同时具备“治疗”逻辑，能精准调控药物递送，与炎症抑制、细胞迁移和软骨生成的生物级联反应相匹配。此外，“一体化”间充质干细胞（MS）通过CCN1/ CYR61介导下游整合素/PI3K/Akt信号通路激活，展现出对软骨基质间充质干细胞（SF-MSCs）的卓越调控作用，有效促进软骨修复。更重要的是，这种生物活性“一体化”MS能显著延长干细胞在关节中的滞留时间，并加速软骨修复进程，其再生组织在体内呈现出与天然透明软骨相似的特性。这不仅彰显了生物活性“一体化”MS促进软骨再生的强大能力，更为相关疾病的治疗提供了新思路。该技术操作简便、生产快捷且无需侵入，具有广阔临床应用前景。除膝关节软骨外，这种生物活性“一体化”MS还可作为理想微载体，为其他关节软骨的再生提供支持。

本文内容来自期刊Chemical Engineering Journal 2025年发表,以3D printing programmed diagnostic and therapeutic bioactive “all-in-one”microspheres with multistimuli responsiveness for cartilage regeneration为题的文章。原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.163898

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